代謝重編程是癌癥的重要標志，它為癌癥患者創造了新的治療機會并推動越來越多的抗癌藥物發現。最近，人們越來越認識到生化通路改變通常會誘發癌細胞代謝的弱點。代謝重編程被認為是由代謝酶的遺傳改變或致癌基因激活引起的。目前，只鑒定到少數代謝酶基因的異常。在代謝變化中，致癌因子活化的癌細胞是否會表現出代謝偏向性尚不清楚。酪氨酸激酶受體（RTK），如表皮生長因子受體（EGFR）和成纖維細胞生長因子受體（FGFR），是公認的各種癌癥惡性生長的致癌因子。迄今為止，RTK基因改變代表了人類癌癥中最明確的遺傳亞型，特別是在非小細胞肺癌（NSCLC）中。雖然越來越多的證據證明了RTK對代謝網絡重編程的影響，但RTK驅動的代謝編程是否導致代謝弱點而具有治療潛力仍未可知。中科院上海藥物所黃敏研究團隊和廈門大學生科院林樹海教授通過非靶向代謝組學、多種穩定同位素標記的代謝流分析及轉錄組學等技術闡述了癌癥基因型和代謝依賴之間的分子聯系，為靶向代謝治療中的患者分層提供了依據，相關成果發表于《Nature Communications》。
RTK的代謝表型重編程
采用藥理學抑制劑篩查驗證RTK改變導致的癌癥代謝弱點。選用癌基因表達異常的15株NSCLC細胞株，包括EGFR突變（L858R，外顯子19缺失或外顯子21缺失），FGFR1擴增，KRAS突變等，暴露于靶向葡萄糖和谷氨酰胺酶或脂肪酸氧化的代謝抑制劑中。生長抑制率的聚類結果表明，相同基因型的癌細胞具有相似的代謝弱點，特別是對于表現出聚集趨勢的FGFR和EGFR異常細胞。為了證實這一發現的臨床相關性，作者從TCGA數據庫中提取了740例肺腺癌，其中54例患者分別接受了EGFR激活突變（n = 25），FGFR1 /2擴增（n = 15），MET擴增（n = 12），RET融合（n = 2）。在這些樣本中，基于KEGG數據庫中注釋的1498個代謝基因的層次聚類結果表明，EGFR-，FGFR-和RET-激活的腫瘤存在不同的表達模式，提示在RTK驅動的癌癥中致癌基因存在顯著的代謝表型差異。
為了探究RTK進行代謝網絡重編程的偏向性，將致癌基因EGFR（EGFR-L858R-T790M），FGFR1（TEL-FGFR1融合體），MET（TPR-MET融合體）或RET（CCDC6-RET融合體）引入BAF3細胞導致激活RTK信號傳導（Fig. 1a），IL3非依賴性細胞生長（Fig. 1b），及對特異性RTK抑制劑的精確敏感性（Fig. 1c），并對這些細胞系的代謝譜進行表征。通過細胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）可知，RTK活化可以促進糖酵解和氧化磷酸化，但RTK基因型之間存在顯著差異（Fig. 1d）。鑒于FGFR基因具有四種亞型，作者還將TEL-FGFR3融合到BAF3細胞中，其導致IL3非依賴性細胞生長和對AZD4547的敏感性。比較分別由FGFR1和FGFR3驅動的BAF3細胞表明，發現兩者ECAR和OCR均增強。因為IL3對BAF3細胞模型非常重要，作者測試IL3對細胞代謝表型的影響。正如預期，IL3的缺失導致BAF3細胞中OCR的顯著變化，因為這些細胞的存活率依賴于IL3。BAF3-RTK細胞受影響較小，這與IL3對細胞生長的影響相關（Fig. 1b）。
對這些細胞系進行非靶向代謝組學分析，鑒定了124個代謝物，單個代謝物的熱圖（Fig. 1e）、主成分分析（PCA）（Fig. 1f）、通路富集分析（倍數大于1.5倍; p <0.01）突出了惡性細胞生長所需要的幾種代謝途徑，尤其是檸檬酸循環（TCA循環），核苷酸生物合成和氨基酸代謝，在FGFR突變細胞中優先激活TCA循環，在BAF3-RET細胞中谷氨酰胺/谷氨酸代謝通路顯著增強。
代謝異質性提示增殖細胞營養獲取能力的差異。采用同位素光譜分析（ISA）檢測13C標記的葡萄糖、谷氨酰胺或棕櫚酸在中間代謝物中的摻入，以追蹤三種主要的營養源---葡萄糖，谷氨酰胺和脂肪酸的代謝（Fig. 1g）。每個細胞系中13C標記代謝物的熱圖顯示，BAF3-EGFR和BAF3-FGFR1細胞中葡萄糖代謝增強，BAF3-RET細胞中谷氨酰胺分解顯著增強，MET擴增細胞沒有表現出顯著的代謝特征（Fig. 1h）。
那么RTK驅動細胞的代謝變化是否具有代謝依賴性？結果顯示，BAF3-EGFR和BAF3-FGFR1細胞的增殖依賴于葡萄糖供應，而BAF3-RET細胞的生長似乎依賴于谷氨酰胺供應（Fig. 1i）。檢測9種EGFR突變細胞，4種FGFR1/3擴增細胞和2種RET融合/突變細胞對葡萄糖或谷氨酰胺的生長依賴性，并使用癌癥細胞系百科全書（CCLE）數據庫注釋的無驅動基因改變的7株野生型肺癌細胞（A431除外）作為對照，結果表明，與BAF3-RTK細胞中的觀察一致，EGFR和FGFR突變細胞的生長依賴于葡萄糖而不是谷氨酰胺。相反，對照野生型細胞對葡萄糖或谷氨酰胺的依賴程度不同。RET融合/突變細胞依賴谷氨酰胺進行增殖。與該結果一致，使用UK5099（線粒體-丙酮酸鹽載體抑制劑）選擇性抑制葡萄糖代謝，優先抑制EGFR和FGFR依賴性癌細胞的生長。谷氨酰胺酶抑制劑CB839對RET異常癌細胞的生長表現出更顯著的影響。此外，與脂肪酸β-氧化示蹤一致（Fig. 1h），使用埃托霉素（ETO）（一種肉毒堿棕櫚酰轉移酶1A（CPT1A）的抑制劑）抑制脂肪酸氧化僅對所有四種基因型細胞的生長有輕微影響。
使用RNA測序（RNA-seq）來探索這些細胞中不同代謝依賴性的遺傳基礎，提示這些BAF3-RTK細胞系中存在顯著差異的基因簇，對這些顯著基因簇進行KEGG通路富集分析，顯示FGFR1和EGFR激活細胞中糖酵解和絲氨酸合成通路過表達（Fig. 1j）。分析EGFR和FGFR激活腫瘤中的代謝基因以探測BAF3細胞轉錄變化的臨床相關性，差異代謝基因的KEGG通路富集分析（FC大于1.5倍; p <0.01）表明，富集到FGFR擴增腫瘤中的丙酮酸代謝和EGFR突變瘤中的甘氨酸絲氨酸和蘇氨酸代謝，這些發現與BAF3細胞中鑒定的基因組結果吻合。這些數據共同證明了由癌細胞中相應的RTK活化驅動的代謝表型重編程的偏向性。
EGFR活化促進絲氨酸合成
以上數據表明EGFR活化后將糖酵解分支到絲氨酸合成通路（SSP）（Fig. 1h）。通過比較EGFR突變的癌癥患者（n = 25）與野生型EGFR腫瘤（n = 715）（圖2a），從TCGA數據庫中提取的740名肺腺癌患者中進一步證實了上調的絲氨酸代謝，提示SSP可能是這種癌癥亞型的臨床相關易感性。用CBR5884（一種PHGDH抑制劑）處理RTK驅動的細胞以降低這些細胞中絲氨酸的從頭合成，結果顯示，BAF3-EGFR細胞對PHGDH抑制有反應，而BAF3-FGFR1細胞對PHGDH抑制無反應（Fig. 2b）。使用NCT503（另一種PHGDH抑制劑）觀察到類似的結果。將具有FGFR1 / 2/3基因擴增的癌細胞和無驅動基因改變的野生型肺癌細胞（A431除外）兩者均作為對照進行測試。使用CBR5884抑制PHGDH，EGFR突變細胞的生長抑制率高于FGFR突變細胞，野生型細胞大多無反應（Fig. 2c）。體內實驗同樣證實了這種代謝弱點：PC9移植模型（Fig. 2d）和具有EGFR L858R突變的NSCLC患者異種移植（PDX）模型LU-01-0251（Fig. 2e）用EGFR抑制劑Gefitinib或NCT503（唯一的PHGDH體內抑制劑）治療，NCT503治療后腫瘤生長受到顯著抑制，略低于Gefitinib的EGFR抑制作用（Fig. 2d，e），但毒性最小。這些結果表明，EGFR驅動的癌癥代謝弱點導致SSP依賴性。最近的研究還報道了SSP參與EGFR抑制劑的耐藥性，從不同的角度證實了SSP在EGFR突變型癌癥中的重要作用。
接下來作者探究絲氨酸生成的增加如何促進EGFR依賴性癌細胞的惡性生長。使用13C標記的葡萄糖作為示蹤劑，BAF3-FGFR1細胞作為對照，檢測BAF3-EGFR細胞中13C標記的核苷酸同位素異構體的貢獻百分比（Fig. 2f），EGFR驅動細胞中M6-M9核苷酸同位素的比例增加，這表明甘氨酸和甲酸碳結合到嘌呤核苷酸中（Fig. 2f，g）。除核苷酸合成外，葡萄糖衍生的絲氨酸可通過甘氨酸的產生摻入谷胱甘肽（GSH）中，有助于氧化還原穩態。同時，13C標記的葡萄糖示蹤LC-MS譜檢測到葡萄糖衍生的GSH（M2同位素）也通過激活BAF3細胞中的EGFR而增強。與FGFR1擴增的DMS114細胞相比，敲低PHGDH或磷酸化絲氨酸磷酸酶（PSPH）使得EGFR突變的PC9細胞中的活性氧（ROS）增加。這些結果表明EGFR通過促進SSP來為DNA / RNA合成提供核苷酸。與FGFR1活化細胞相比，EGFR活化細胞相對較少依賴于絲氨酸的外源供應（Fig. 2h）。
EGFR活化究竟如何優先激活SSP？通過比較BAF3-EGFR和BAF3-FGFR1細胞之間SSP相關酶的表達，發現在EGFR活化后PSPH、絲氨酸羥甲基轉移酶1（SHMT1），SHMT2和亞甲基四氫葉酸脫氫酶1（MTHFD1）等關鍵代謝酶特異性上調（Fig. 2i）。在同一組肺腺癌患者樣本中觀察到PHGDH和PSPH的顯著上調（Fig. 2j）。通過具有突變EGFR（n = 6）或野生型RTK（n = 6）的NSCLC PDX腫瘤組織中對這些代謝酶進行免疫組織化學分析，結果顯示，與野生型腫瘤相比，EGFR突變體腫瘤表現出更高的PSPH和PHGDH表達水平。而且，PDX模型（LU-01-0251）中上調的PHGDH和PSPH表達可以通過EGFR抑制劑的治療來逆轉（Fig. 2e，k）。
與攜帶野生型EGFR的患者相比，EGFR突變肺癌患者中PSPH（絲氨酸從頭合成的關鍵酶及肝臟中該通路的限速酶）顯著增加（Fig. 2j）。接著，作者調查患者的PSPH狀態（來自TCGA數據庫的1144名患者），發現16％的EGFR突變亞型中PSPH擴增突變和EGFR激活突變（L858R點突變，外顯子19缺失或外顯子21缺失）同時發生（Fig. 2l）。由于兩種基因的遺傳變化同時發生，這類NSCLC患者的SSP顯著增強，提示。PSPH可能是NSCLC中EGFR活化的靶點與此觀點一致，敲低PSPH導致EGFR突變體PC9和NCI-H1975細胞的生長顯著降低，類似于EGFR失活（Fig. 2m）。以上數據突出了SSP作為EGFR突變癌癥中的代謝弱點。
FGFR活化增強有氧糖酵解和乳酸循環
FGFR異常發生在多種類型的人類癌癥中，包括NSCLC，膀胱癌和乳腺癌等。FGFR活化的細胞似乎消耗更多的葡萄糖進入糖酵解通路（Fig.1h），可從乳酸（糖酵解的關鍵產物）的胞內生成和胞外分泌的增強加以證實（Fig. 3a）。鑒于OCR的顯著增強（Fig. 1d），作者推測乳酸可能作為TCA循環的替代碳源。為了支持這一假設，作者通過示蹤13C標記的葡萄糖的碳富集到BAF3- RTK細胞中TCA循環的中間代謝物來檢測葡萄糖對FGFR活化細胞中TCA循環中間體的貢獻百分比（Fig. 3b）。在無標記葡萄糖（10mM）存在下，13C標記的乳酸（5mM）競爭性攝取分析顯示FGFR細胞更傾向于消耗乳酸鹽用于TCA循環（Fig. 3c）。為了追蹤FGFR1擴增的NCI-H1581異種移植模型中葡萄糖和乳酸對TCA循環的貢獻百分比，將13C標記的葡萄糖和13C標記的乳酸共同靜脈注射小鼠30分鐘后收集腫瘤組織，經外周轉化后的血漿乳酸M3或M1同位素強度歸一化后，摻入TCA循環中間體的葡萄糖碳與乳酸碳水平相當（Fig. 3d）。這些結果表明乳酸可以作為TCA循環中與葡萄糖同等的能源。與這些結果一致，使用Oxamate或GSK2837808A29抑制乳酸生成使得FGFR1擴增的NCI-H1581細胞中的OCR水平降低，類似于抑制FGFR的影響（Fig. 3e）。相反，乳酸的產生僅略微影響EGFR依賴性PC9細胞中的線粒體容量。
已知加速氧化磷酸化為惡性腫瘤生長提供ATP， 生成大量ROS副產物。檢測乳酸對FGFR活化細胞中ATP和ROS產生的貢獻，結果表明，在BAF3細胞中，與EGFR激活相比，FGFR1的活化與更高水平的ATP和ROS產生相關（Fig. 3f，g）。FGFR1激活的NCI-H1581細胞中ATP和ROS的產生均可被乳酸脫氫酶（LDH）抑制劑部分逆轉，其程度與FGFR抑制相似（Fig. 3f，g）。總之，乳酸在促進FGFR異常癌的氧化磷酸化中起重要作用。
作者還比較了BAF3細胞中FGFR1或EGFR活化時糖酵解酶的表達。發現一些糖酵解酶如乳酸脫氫酶A（LDHA），ATP依賴性6-磷酸果糖激酶（PFKL），葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）和己糖激酶2（HK2）在BAF3-FGFR1細胞中顯著上調（Fig. 3h）。從TCGA數據庫中提取的740例肺腺癌患者樣品中證實了FGFR擴增與這些酶的上調相關（Fig. 3i）。使用免疫組織化學分析顯示，相比RKT野生型腫瘤組織，FGFR1/2擴增的NSCLC PDX腫瘤組織中LDHA和HK2表達上調（Fig. 3j）。此外，作者使用基于CRISPR / Cas9篩選數據的Project Achilles來揭示細胞生長對這些代謝基因的依賴性。結果表明FGFR擴增的癌細胞中LDHA，PFKL和PKM的依賴性顯著高于FGFR野生型癌細胞。作為對照，對PHGDH和PSPH的依賴性結果顯示各亞組之間無差異，表明FGFR擴增細胞高度依賴于糖酵解。
所有這些發現都表明了乳酸在FGFR驅動的細胞中的重要作用。使用GSK2837808A（高選擇性的LDHA抑制劑）抑制Fig. 2c所述癌細胞中的乳酸產生，與對照細胞相比，FGFR異常細胞的生長對LDH抑制劑更敏感（Fig. 3k），表明FGFR驅動的惡性生長優先需要乳酸代謝。在SNU16和NCI-H1581異種移植模型中乳酸抑制劑Oxamate顯著抑制腫瘤生長且小鼠體重未發生變化（Fig. 31）；13C葡萄糖示蹤顯示腫瘤中乳酸和檸檬酸生成降低（Fig. 3l）。在兩個FGFR2擴增的NSCLC PDX模型中檢測Oxamate的效果，結果顯示在LU6429模型中，Oxamate或AZD4547的療效都顯著，但不同腫瘤之間療效不同。在腫瘤生長抑制中，使用AZD4547-Oxamate組合對LDH和FGFR的組合抑制比單獨的FGFR抑制效果更普遍且持續時間長（Fig. 3m），提示可以降低FGFR抑制劑的耐藥性。小鼠體重變化提示組合研究具有良好的耐受性。在另一個FGFR2擴增模型LU0743中也觀察到類似的趨勢。同時，使用二甲雙胍阻斷線粒體呼吸，由于回收的乳酸被用于促進氧化磷酸化，與抑制乳酸生成相比，二甲雙胍表現出相似的效果（Fig. 3m）。總之，這些結果表明在FGFR擴增的癌癥中乳酸生成和氧化磷酸化的重要性，并提示由這種代謝表型產生的治療前景。
前面結果表明，EGFR和FGFR基因的改變可以分別用于對SSP和乳酸產生抑制劑有反應的腫瘤進行分層。為了強化這一結果，作者還測試了攜帶野生型RTK的腫瘤模型。A431細胞異種移植常被用作RTK研究的對照，但PHGDH或LDH抑制劑幾乎沒有響應。同樣，在無驅動基因改變的3種NSCLC PDX模型中（LU-01-0393，LU2071和LU-01-0416），未觀察到明顯治療效果。這強調了患者選擇這些抑制劑的重要性。
ATF4和MYC調控代謝重編程
剩下的問題是EGFR和FGFR細胞的優先代謝重編程？先前的證據突出了轉錄因子（TFs）作為癌細胞中代謝網絡重編程的關鍵節點作用。作者探究FGFR和EGFR依賴性細胞中轉錄組重編程的TF。根據BAF3細胞中的RNA-seq數據，對RTK激活的代謝基因進行了分層（由KEGG數據庫注釋），并根據已發布的TF數據庫（Cistrom，ORegAnno，mSigDB，CellNet和UCSC）建立描述TF-靶標互作的網絡模型，分別獲得了127個TF參與調節EGFR和138個TF參與調節FGFR依賴性差異轉錄的代謝酶。通過生物信息學注釋進行功能性篩選：根據TF-靶標互作網絡， 在FGFR3依賴的RT112細胞和EGFR激活的PC9細胞中，敲低25個代表性TF，并通過RT-qPCR分析檢測SSP中PSPH，PHGDH的表達，以及糖酵解中LDHA，GLUT1的表達。最終在FGFR依賴性癌細胞中篩選出的ATF4，FOXO1，HIF1A，MAF，MYC和SREBP1，在EGFR依賴性癌細胞中篩選出的ATF4和MYC，分別是糖酵解和SSP中特征基因轉錄所必需的（Fig. 4a）。在這些TF中，只有HIF1A和MYC表達受FGFR抑制的顯著影響。同樣地，EGFR抑制劑Gefitinib可以影響EGFR突變癌細胞（Fig. 4b）和移植模型（Fig. 4c）中的ATF4和MYC表達。此外， MYC而非ATF4的敲低顯著抑制FGFR3活化的RT112細胞的生長；而在EGFR異常的PC9細胞中，ATF4的敲低顯著抑制細胞生長（Fig. 4d）。這些數據表明，HIF1A-MYC（在FGFR依賴細胞中）和ATF4-MYC（在EGFR活化細胞中）在轉錄調節代謝網絡中發揮著至關重要的作用，MYC和ATF4分別在FGFR依賴的細胞和EGFR活化細胞中發揮著更為主導的作用。
通過網絡分析來驗證TF對在調節代謝網絡中的密切關聯，結果顯示，有10個代謝基因由EGFR細胞中的MYC和ATF4共同調節，其中包括PSPH；20多個代謝酶基因由FGFR細胞中的HIF1A和MYC共同調控，其中包括LDHA（Fig. 4e）。仔細剖析這些TF對在兩種細胞環境中的作用，發現敲低MYC下調HIF1A表達，而敲低HIF1A時MYC不變，證明MYC在FGFR細胞中的主導作用；同樣的，在EGFR活化的PC9細胞中，敲低ATF4下調MYC表達，而敲低MYC時ATF4不變，證明ATF4在EGFR細胞中的主導作用（Fig. 4f）。接著，探究這些TFs對代謝表型的影響。與上述結果一致，FGFR活化的癌細胞中丙酮酸和乳酸的胞內生成通過MYC降低，而不是通過ATF4消耗而降低（Fig. 4g）。同時，在13C標記葡萄糖的ISA測定中，敲低ATF4而非MYC顯著抑制PC9細胞中絲氨酸和核苷酸的合成，類似于EGFR抑制（Fig. 4h）。綜上，作者建立了RTK驅動的轉錄調控網絡，并突出了在EGFR或FGFR突變的癌癥中，轉錄因子ATF4和MYC是代謝網絡優先重編程的關鍵節點（Fig. 4i）。
小結
本研究采用代謝組學和轉錄組學相結合的方法來識別RTK驅動的癌癥代謝弱點，建立了代謝弱點與癌癥基因型之間的聯系，確定了RTK異常的癌癥代謝偏向性，提示RTKs的改變可用于代謝抑制劑的患者分層。FGFR致癌信號主要集中在MYC上，用于下游糖酵解酶的轉錄調控，而EGFR激活優先利用ATF4來驅動代謝網絡重編程。總之，本研究確定了糖酵解和由此產生的乳酸的關鍵作用，它為FGFR異常癌癥的能量生成提供TCA循環，并為EGFR組成性激活癌的核苷酸生物合成和氧化還原穩態的絲氨酸合成提供燃料。本研究可以從兩個方面推進當前對該領域的理解：一方面，致癌的RTK驅動的代謝重編程可能導致明顯的代謝弱點，可用于癌癥治療。另一方面，代謝異質性是由轉錄因子介導的代謝基因表達差異造成的。這些發現對指導代謝抑制劑的患者分層具有重要的轉化醫學價值。
參考文獻
Jin N et al., Identification of metabolic vulnerabilities of receptor tyrosine kinases-driven cancer. Nat Commun. 2019 doi: 10.1038/s41467-019-10427-2.
原創： 麥特繪譜 麥特繪譜
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