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糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)是糖尿病管理的重要指標。2011年世界衛生組織(World Health Organization, WHO)發布報告，推薦在有條件的地區采用HbA1c診斷糖尿病[1]。HbA1c實驗室測定結果準確可比，實現檢測的標準化，是HbA1c臨床應用的重要前提和保障。經過多年努力，國內外糖化血紅蛋白的標準化工作已取得較大進展[2,3,4]。我國目前已建立了完整的HbA1c參考系統，包括國際臨床化學與檢驗醫學聯合會(International Federation of Clinical Chemistry，IFCC)發布的糖化血紅蛋白一級參考測量程序[5,6]，國家一級標準物質和數個參考實驗室[7]。充分利用參考系統，提高檢測質量，是糖化血紅蛋白標準化的重要工作內容之一。

方法學評價是研究和評價檢測方法性能的常用手段。以往受條件限制，臨床實驗室多采用已獲得臨床驗證的常規方法或者自選方法作為參比方法，所得數據存在一定的局限性。參考方法是方法學評價首選的參比方法。本研究以IFCC糖化血紅蛋白參考方法為參比方法，對臨床上常用的4種離子交換高效液相色譜法檢測系統和1種毛細管電泳檢測系統的正確度進行考察，以及精密度、線性和分析干擾的評價，為參考方法在糖化血紅蛋白檢測系統的方法學評價研究中的應用提供實例。

材料與方法

一、材料

1．溶血液樣本：

收集北京醫院檢驗科和內分泌科、北京協和醫院檢驗科2017年9至10月表觀正常體檢者及糖尿病患者檢測后剩余的乙二胺四乙酸二鉀(Dipotassium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate，EDTA-2K)抗凝外周血若干，剔除外觀明顯黃疸、脂血和乳糜等異常樣本，置于4 ℃保存。挑選濃度范圍均勻分布在22 mmol/mol～147 mmol/mol(4.2%～15.6%，National GlycohemoglobinStandardization Program，美國國家糖化血紅蛋白標準化計劃，NGSP單位)的樣本于48 h內按照IFCC參考方法標準操作程序[5]制成單人溶血液樣本40份，分裝后－80℃保存，用于正確度考察。本研究樣本收集經北京醫院倫理委員會批準豁免簽署受試者知情同意書(倫理審查批件號2016BJYYEC-121-02)。

2．全血樣本：

按上述程序收集北京醫院檢驗科和內分泌科、北京協和醫院檢驗科2018年4至6月表觀正常體檢者及糖尿病患者剩余EDTA抗凝外周血若干，樣本濃度范圍為20 mmol/mol～143 mmol/mol(4.0%～15.3%，NGSP單位)，置－80 ℃保存。使用前，室溫放置30 min充分融化后按照研究方案制成各種混合全血樣本用于精密度、線性及分析干擾研究(見下文"方法學評價")。

3．儀器和試劑：

5個糖化血紅蛋白檢測系統分別為(按中文名稱拼音排序)：愛科來(Arkray,日本)ADAMS? HA-8180分析儀及其配套試劑和校準品(試劑批號：8A1321)，離子交換高效液相色譜法(簡稱8180)；伯樂(Bio-Rad，美國)Variant? Ⅱ分析儀及其配套試劑和校準品(試劑批號：64093321/64093322/64139366)，離子交換高效液相色譜法(簡稱VariantⅡ)；東曹(TOSOH，日本)HLC-723 G8分析儀及其配套試劑和校準品(試劑批號：K8-201D/8-303C)，離子交換高效液相色譜法(簡稱G8)；上海惠中MQ-6000分析儀及其配套試劑和校準品(試劑批號：20180510E)，離子交換高效液相色譜法(簡稱6000)；Sebia(法國)Capillarys 2 Flex-Piercing分析儀及其配套試劑和校準品(試劑批號：6067180)，毛細管電泳法(簡稱Capillarys2)。

IFCC參考方法使用的主要分析儀器為液相色譜串聯質譜聯用系統(liquid chromatography-tandemmass spectrometry，LC-MS/MS)，包括高效液相色譜儀Agilent 1200(Agilent，美國)、串聯三重四極桿質譜儀API 5000和Analyst 1.4.2數據處理軟件(Applied Biosystems，美國)以及配有餾分收集器(型號G1364C)和紫外檢測器的高效液相色譜儀Agilent 1200(Agilent，美國)。校準品為IFCC糖化血紅蛋白參考實驗室網絡指定一級參考物質pcal-2014，包括6個水平，濃度范圍為0～160mmol/mol。蛋白內切酶(endoproteinase Glu-C)購自羅氏診斷產品有限公司(Roche，瑞士)，用去離子水配制為200μg/ml溶液。用于正確度質控的糖化血紅蛋白國家一級標準物質GBW09181a、09182a和09183a來自北京醫院。

二、IFCC參考方法測定

1．酶切：

取20 μl溶血液樣本或30 μl校準品于2 ml樣品瓶中，加入50 μl內切酶溶液及420 μl乙酸銨緩沖液(50 mmol/L，pH 4.3)，混勻密封后置于37 ℃(±0.5 ℃)溫育18～20 h。取出置于－20 ℃及以下停止酶切反應。使用前從冰箱取出，室溫放置15 min后進行多肽純化。

2．多肽純化：

純化過程使用的色譜柱為Zorbax XDB C18柱(4.6 mm×150 mm，粒徑5 μm，Agilent，美國)。流動相A液為水(含0.05%三氟乙酸)，B液為乙腈(含0.05%三氟乙酸)，洗脫梯度為B液在5 min內由12%增加至30%，其后在0.1 min內變化至100%并保持1 min。最后在0.1min內返回至12%，在3.8 min后達到平衡。整個梯度洗脫循環總計10 min。每個樣本進樣25 μl,采集波長為214 nm，使用餾分收集器收集3.9 min至4.5 min的組分，加入等體積的去離子水供LC-MS/MS測定。

3．LC-MS/MS測定：

使用色譜柱為Sunfire? C18柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm，Waters，美國)，流動相水(含0.1%甲酸)：乙腈(88∶12)，流速為0.2 ml/min，進樣體積為1 μl。質譜分析采用電噴霧電離源，正離子分析模式，多反應監測掃描方式，監測的離子轉變為m/z 348.3→245.1(非糖化β鏈N-末端六肽)和m/z 429.4→245.1(糖化β鏈N-末端六肽)。噴霧氣、霧化輔助加熱氣、氣簾氣和碰撞氣均為氮氣，分別為60 psi、70 psi、25 psi和6 psi，霧化輔助加熱氣加熱溫度為500 ℃。去簇電壓、入口電壓和噴霧電壓分別為30 V、6 V和5 500 V。出口電壓和碰撞能量對離子轉變m/z 348.3→245.18 V和35V，對m/z 429.4→245.1為11 V和36 V。

4．分析過程：

將校準品和樣本隨機穿插，以正序和逆序重復測定2次。以兩次進樣所得數據的均值為測定結果。

5．數據處理：

以校準品糖化六肽和非糖化六肽的峰面積比(rsig)對濃度比(rconc)做回歸曲線得到校準方程，由此計算得到待測樣本的rconc，按照下式計算糖化血紅蛋白水平(Zconc，mmol/mol)。NGSP單位結果由主方程NGSP＝0.091 48 IFCC ＋2.152換算得到。

三、方法學評價

1．正確度：

將溶血樣本從冰箱中取出，室溫放置15 min融化，充分混勻。參照美國臨床和實驗室標準研究所(Clinical andLaboratory Standards Institute，CLSI)EP9-A3的評價方案，使用5個HbA1c檢測系統，以手工模式對40份溶血液樣本進行預稀釋后測定，稀釋劑及稀釋比例按照各系統推薦的程序操作。每個樣本重復測定3次，將所得數據的均值作為測定結果。用廣義極端學生化偏差(extremestudentized deviate，ESD)方法檢驗離群值點。以IFCC參考方法比對參比方法，繪制偏差圖進行初步偏倚評估，使用普通線性回歸(ordinarylinear regression，OLR)模型作回歸分析。計算兩個醫學決定水平6.5%(48 mmol/mol，美國糖尿病學會推薦的糖尿病診斷標準)、7.0%(53 mmol/mol，美國糖尿病學會推薦的糖尿病患者控制標準)處的預期偏移。

2．精密度：

按照行業標準《WS/T 492-2016臨床檢驗定量測定項目精密度與正確度性能驗證》的評價方案，制備高低兩個水平的混合冰凍全血樣本，在各系統上以自動稀釋模式測定樣本。每天分析一批，每個水平同一樣品重復測定3次，連續測定5 d，計算實驗室內精密度變異系數(coefficient of variance，CV)。

3．線性：

依據CLSI EP6-A文件的評估方案，選取低值(20 mmol/mol，4.0 %HbA1c)和高值(144 mmol/mol，15.3%HbA1c)全血樣本各1份，按照一定比例將兩者稀釋混合，得到7個不同濃度的樣本，在各系統上以手工模式稀釋樣本后進行測定，每個濃度水平測定2次，將所得數據的均值作為測定結果。以理論糖化血紅蛋白濃度(根據高值、低值樣本的糖化血紅蛋白濃度和稀釋比例分別計算)為自變量，測定結果為因變量進行多項式線性評價。

4．分析干擾：

依據CLSI EP7-A2文件的方案，制備HbA1c濃度約為31 mmol/mol和69 mmol/mol(5%和8.5%)EDTA-全血2份作為基礎樣本，分別加入下述干擾物質，每種干擾物質添加5種不同濃度，包括結合溶血血紅蛋白(1 000 mg/dl～5 000 mg/dl)、乳糜(100 FTU～1 400 FTU)、膽紅素(1 mg/dl～18 mg/dl)、阿司匹林(10 mg/L～160 mg/L)和維生素C(2.5 mg/dl～50 mg/dl)。另制備添加不同濃度葡萄糖(5 mmol/L～250 mmol/L)的樣本，于37 ℃水浴孵育3 h后取出置于－20 ℃保存備用。在5個系統上以手工模式稀釋樣本后進行測定各個干擾樣本，每種每個濃度水平測定2次，將所得數據的均值作為測定結果。

5．統計學分析：

用Microsoft Excel 2010軟件對正確度、精密度、線性和分析干擾的實驗結果進行統計。

結果

一、IFCC參考方法測定結果

40個溶血液樣本分為4批測定，每批20個樣本，每個樣本重復測定兩批。每批測定同時測定國家一級標準物質GBW 09181a、09182a或09183a作為正確度質控。40個樣本重復測定的平均CV為1.4%(范圍0.2%～2.5%)。4個批次正確度質控品與靶值的相對偏倚為－1.6%～ 0.13%，均包含在所用標準物質的擴展相對不確定度(k＝2)范圍內。

二、方法學評價結果

1．正確度：

對5個HbA1c系統40份溶血液樣本的測定結果用ESD方法檢驗，未發現離群值。8180、VariantⅡ、G8、6000和Capillarys 2的最大偏移(ESD1)依次分別為2.57、3.04、2.47、2.78和2.41，臨界值

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